Материалы и методы исследования

. Полученные результаты можно документировать фотографированием гелей с использованием оранжевого или интерференционного (594 нм) светофильтра.

Таблица 3 - Размер фрагментов ДНК

Рис. 1 - Визуализация результатов электрофореза, при исследовании биопроб на наличие Хеликобактер пилори методом ПЦР

Выявление гена CagA H. pylori

Первое выявление гена CagA H.pylori проводили с использованием коммерческого набора реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА. Ниже представлены условия проведения ПЦР выявления генотипа CagA H.pylori с использованием коммерческого набора реагентов

Состав компонентов реакционной смеси для выявления генотипа CagA H.pylori

ХЕЛИКОПОЛ СА:

Вода деионизованная14,3 мкл

ПЦР-буфер3 мкл

Раствор дНТФ3 мкл,5 мкл

Смесь праймеров cagA2 мклполимераза (5ед/мкл).0,2 мкл

Таблица 4 - Программа амплификации для выявления генотипа CagA H. pylori

Проведение ПЦР (амплификацию) и электрофоретическую детекцию проводили аналогично предыдущему исследованию.[23]

Полученные результаты:

Рис. 2 - Детекция ПЦР-продукта методом гель-электрофореза, при определении генотипа CagA H.pylori, с использованием коммерческого набора реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА

Вторично проводили выявление генотипа CagA H.pylori характеризующего западный тип при помощи последовательности праймеров взятых нами из открытого источника.

Используемые нами праймеры были синтезированы ОДО «Праймтех» г. Минск, Беларусь. Каждая пара праймеров имела паспорт, где указывались последовательность, концентрация, температура плавления, молекулярный вес, соотношение GC и OD260/OD280.

Последовательность праймеров для выявления гена CagA H.pylori характеризующего западный тип размером 501 нуклеотидная пара.

CagAWestеrn F

/- GGA ACC CTA GTC GGT AAT G 3/-еrn R

/- TTT CAA AGG GAA AGG TCC GCC 3/-

Состав компонентов реакционной смеси для выявления генотипа CagA H.pylori,характеризующего западный тип из расчета на 1 анализ.

-х DreamTag PCR Master Miх (DreamTag PCR Green buffer, DreamTag DNA polymerase , 4мМ MgCl2, Смесь нуклеотидов дНТФ 10 мМ) -12,5 мкл.

Праймер CagA Westеrn F 10 мМ - 1 мкл

Праймер CagA Westеrn R 10 мМ - 1 мкл

Вода деионизованная - 8,5 мкл

Препарат ДНК с концентрацией 20 - 40 нг/мкл - 1мкл

Программа амплификации для выявления генотипа CagA H. pylori характеризующего западный тип

С пауза

С 5 мин. 1 цикл

С 30 сек

С 30 сек 35 циклов

С 40 сек

С 5 мин 1цикл

С хранение

Проведение ПЦP - исследования

В ПЦР-пробирку вносили 24мкл реакционной смеси, добавляли 1 мкл образца исходной ДНК с концентрацией 20-40нг/мкл и помещали пробирки в амплификатор Palm Cycler фирмы «Corbett Research» (Австралия) для проведения амплификации по соответствующей программе.

Детекция ПЦР-продукта методом гель-электрофореза

Детекцию ПЦР-продуктов проводили в горизонтальной электрофоретической камере типа «Хеликон», Россия, используя 1,7-2% агарозные гели.

Для приготовления агарозных гелей агарозу растворяли в 1,5 M Трис-ЭДТА-боратном буфере c бромистым этидием (0,5мкг/мл) путем нагревания смеси. Затем горячий раствор заливали в специальную камеру и с помощью гребенок формировали лунки. После застывания гель помещали в камеру для проведения электрофореза, содержащую Трис-ЭДТА-боратный буфер и вносили в лунки геля продукты амплификации. После загрузки гелей камеру подключали к источнику питания типа Эльф-4 и устанавливали нужные параметры напряжения и силы тока.