Материалы и методы исследования

Материалы исследования

В исследовании участвовало население гомельской области:

Случайная репрезентативная выборка взрослого населения: 71 человек в возрасте 13-83лет, из них 22 мужчины (средний возраст 38,4 года) и 49 женщин (средний возраст 40,6 года).

Для выявления гастроэнтерологической патологии у обследуемых лиц использовали данные эндоскопических и гистологических исследований, а так же данные полученные в молекулярно-генетической лаборатории, на наличие у обследуемых Helicobacter pylori.

Биопсийный материал обследуемых лиц исследовался методом ПЦР-Хеликопол НПФ «ЛИТЕХ», г. Москва, для определения присутствия Helicobacter pylori в исследуемых образцах, а выявление гена CagA H. pylori проводили при помощи двух наборов: первый коммерческий набор реагентов НПФ «ЛИТЕХ» г. Москва - ХЕЛИКОПОЛ СА, второй набор состоит из последовательности праймеров взятых нами из открытого источника, которые были синтезированы ОДО «Праймтех» г. Минск, Беларусь.[23]

Методы исследования

Методика проведения исследования клинического материала (биоптат слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки) на наличие ДНК Хеликобактер пилори методом ПЦР:

«Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ (Helicobacter pylori)».

Принцип работы метода:

В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК микроорганизма путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК-мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК.

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК-мишени в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксинуклеозид-трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК-мишени.

Каждый цикл состоит из трех стадий с различными температурными режимами. На первой стадии при 94оC происходит разделение цепей ДНК, затем при 57-62оС - присоединение (отжиг) праймеров к гомологичным последовательностям на ДНК-мишени, и при температуре 72оC протекает синтез новых цепей ДНК путем удлинения праймера в направлении 5’-3'.

В каждом цикле происходит удвоение числа копий амплифицируемого участка, что позволяет за 35 циклов наработать фрагмент ДНК, ограниченный парой выбранных праймеров, в количестве, достаточном для его детекции с помощью электрофореза.

Проведение ПЦР-анализа включает 3 лабораторных этапа:

. обработка клинических проб (выделение ДНК);

. постановка реакции ПЦР (амплификация);

. детекция продуктов амплификации (в данной методике - электрофоретическое разделение продуктов в агарозном геле).

Необходимое оборудование и расходные материалы:

этап - выделение ДНК из биопроб:

ламинарный бокс 2 класса защиты;

твердотельный термостат для пробирок 1,5 мл типа Эппендорф, поддерживающий температуру до 99оС;

высокоскоростная центрифуга для пробирок 1,5 мл 8-12 тыс.об/мин;

центрифуга для пробирок 50 мл 1,5-3тыс.об/мин;

микроцетрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин (или вортекс);

пипетки-дозаторы переменного объема ( 5-50; 20-200; 100-1000 мкл);

вакуумный аспиратор (насос) с колбой-ловушкой;

штатив для хранения пробирок 1,5 мл;

штатив для пробирок 1,5 мл «рабочее место»;

одноразовые наконечники для дозаторов до 200 мкл и до 1000 мкл;

холодильник с морозильной камерой для хранения клинического материала;

одноразовые перчатки;

комплект «Набор для выделения ДНК из биоптата для ХЕЛИКОПОЛ»

этап - проведение ПЦР (амплификация):

ПЦР-бокс с УФ-лампой;

программируемый термостат амплификатор;

микроцентрифуга-вортекс 1,5-3тыс.об/мин;

пипетка-дозатор переменного объема 5 - 50 мкл для работы с биопробами;

пипетки-дозаторы переменного объема (0,5 - 10; 5-50; 20-200; 100-1000 мкл) для приготовления рабочей смеси реагентов;

одноразовые полипропиленовые микропробирки 0,5 мл (или 0,2 мл) для амплификации;

одноразовые наконечники до 200 мкл и до 1000 мкл для приготовления рабочей смеси реагентов;

одноразовые наконечники с фильтром (аэрозольным барьером) до 100 или до 200 мкл для биопроб;

штатив для пробирок 0,5 мл (или 0,2 мл) «рабочее место»;

штативы для наконечников 200 мкл;

одноразовые перчатки;

емкость для сброса использованных наконечников;

холодильник с морозильной камерой для хранения исходных реагентов;

комплект реагентов для проведения ПЦР (индивидуален для каждого возбудителя);

этап - детекция продуктов амплификации:

камера для горизонтального электрофореза;

источник постоянного тока с напряжением не менее 150 В;

УФ-трансиллюминатор;

СВЧ-печь для плавления агарозы;

технические весы для взвешивания агарозы;

видеосистема для документирования гель-электрофореграмм со светозащитным кабинетом или тубусом, подключенная к персональному компьютеру;

пипетка-дозатор переменного объема 5-50 мкл для нанесения образцов на гель;

пипетка-дозатор переменного объема 100-1000 мкл;

одноразовые наконечники до 200 мкл для нанесения образцов;