Материалы и методы исследования

. Добавить по 20 мкл амплификационной смеси во все пробирки, подготовленные для амплификации (для ХЕДИКОПОЛ СА, VA, BA и IA-по 25 мкл).

. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.

. Внести 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы (см п. выделение ДНК) в соответствующую пробирку с амплификационной смесью для проведения амплификации под слой масла.

. Внести в пробирки для положительных контрольных образцов по 5 мкл соответствующего положительного контрольного образца ДНК из состава набора, а в пробирку для отрицательного контрольного образца - 5 мкл разбавителя или деионизованной воды из состава набора.

. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 2250 - 4000g (1,5 -3000 об/мин) при комнатной температуре (+18 - 25оС) на микроцентрифуге-вортексе.

. Перенести пробирки в прогретый до температуры +93оС программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по следующим программам:

Таблица 2 - Программа амплификации для выявления H. pylori

Детекция продуктов амплификации:

Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза.

. Залить в аппарат для электрофореза ТАЕ буфер, приготовленный на дистиллированной воде разбавлением 50хТАЕ в 50 раз.

. К 2,0 г агарозы добавить 2 мл 50х ТАЕ буфера и 100 мл дистиллированной воды.

. Приготовленную смесь расплавить на электрической плите или в СВЧ-печи. Добавить к 100 мл расплавленной агарозы 10 мкл 1% раствора бромистого этидия. Перемешать.

. Охладить расплавленную агарозу до температуры 50-60оС и залить в планшет для заливки геля. Для получения в агарозном геле карманов для нанесения образцов установить на планшет гребенку, используя зажим типа «бульдог». После застывания агарозы осторожно вынуть гребенку из геля и перенести планшет с гелем в камеру для проведения электрофореза.

. Нанести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата в последовательности соответствующей нумерации проб. Нанести положительные и отрицательные контроли.

. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение, соответствующее напряженности электрического поля 10-15 В/См геля. Провести электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляется визуально по движению полосы красителя. Полоса красителя должна пройти от старта 1,5-2см.

Визуализация результатов электрофореза

. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло УФ-трансиллюминатора.

ВНИМАНИЕ! С гелем агарозы следует работать в перчатках. Бромистый этидий является сильным мутагеном.

. Включить трансиллюминатор и проанализировать результаты анализа. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос при облучении УФ-излучением с длиной волны 310 нм.

Анализ результатов

. В отрицательном контрольном образце (К-) полосы должны отсутствовать.

Появление полосы на уровне положительного контроля свидетельствует о контаминации (загрязнении) компонентов набора.

. В положительных контрольных образцах (К+) должна выявляться одна полоса, соответствующая ПК.

. Анализируемые пробы:

отсутствие полосы оранжево-красного цвета строго на уровне положительного контроля (ПК) свидетельствует об отсутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе; наличие полосы, соответствующей по электрофоретической подвижности положительному контролю - о присутствии ДНК искомого возбудителя в анализируемой пробе.