Качественный анализ липофильной фракции
Качественный анализ полученной фракции на наличие биологически активных соединений проводили с помощью качественных реакций, бумажной (БХ) и тонкослойной (ТСХ) хроматографии, УФ-спектроскопии.
Качественный анализ липофильной фракции на наличие стероидных соединений
1. Реакция Сальковского
Несколько мг экстракта растворяли в 2 мл хлороформа. К полученному раствору осторожно, по стенкам пробирки, добавляли концентрированную серную кислоту. Через некоторое время хлороформный слой окрасился в оранжево-красный цвет.
2. Реакция Либермана-Бурхарда
Реакцию проводили на выпарительной чашке. Несколько мг экстракта растворили в 2 мл хлороформа, добавили 10 капель уксусного ангидрида и 3 капли концентрированной серной кислоты. Наблюдали синюю окраску, переходящую в красно-бурую.
Наличие фитостеринов в экстракте определяли также с помощью ТСХ на силикагеле ЛС-5/40 m в системах растворителей: петролейный эфир - ацетон (7:3)
В качестве реагентов-проявителей использовали концентрированную серную кислоту и реактив Либермана-Бурхарда, который готовили осторожным смешиванием 20 мл охлажденного до 0°С укусного ангидрида и 5 мл концентрированной серной кислоты. На хроматограммах наблюдали пятно, которое под действием конц.H2SO4 окрашивалось в темно - бурый цвет (Rf = 0.78), а после обработки реактивом Либермана-Бурхарда в зеленую, переходящей в синюю, окраску (Rf = 0.84).
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о том, что экстракт содержит фитостероиды.
Качественный анализ липофильной фракции на наличие каротиноидов и других терпенов
Для предварительного исследования экстракта на наличие каротиноидов 0,1 г растворяли в 2 мл хлороформа, добавляли 2 капли хлорида сурьмы (III). Наблюдали синее окрашивание, характерное для каротиноидов.
Обнаружение каротиноидов методом ТСХ проводили на пластинках “Silufol” и на стеклянных пластинках с закрепленным слоем силикагеля ЛС 5/40m. Исследуемый экстракт обрабатывали гексаном и полученные извлечения подвергали хроматографированию в системе растворителей: петролейный эфир - бензол (6:9). В видимом свете наблюдали три желтых пятна. Хроматограмму опрыскивали насыщенным раствором треххлористой сурьмы в хлороформе, пятна окрашивались в синий цвет. Rf пятен: 0,15; 0,40; 0,69, соответственно. Другую хроматограмму, из той же системы растворителей, обрабатывали концентрированной серной кислотой. По истечению 2 - 3 минут также наблюдали три пятна сине - зеленого цвета.
Хроматографирование в тех же условиях использовали для препаративного разделения каротиноидов. Зону, имеющую наиболее интенсивную окраску в видимом свете и после обработки треххлористой сурьмой, элюировали гексаном и исследовали с помощью УФ - спектроскопии.
В УФ - свете наблюдали максимумы поглощения при длинах волн lmax (гексан) 472, 444 и 420 нм. Такие максимумы, по данным литературы, характерны для каротиноидов, в частности, виолоксантина. Кроме того извлечение давало реакции, характерные для виолоксантина: при добавлении ледяной уксусной кислоты появилась окраска зеленого цвета, а при добавлении концентрированной серной кислоты - синее.