Преимущества ПЦР и возможные ошибки при реализации методики

Возможность экспертизы

Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами (Петрова, 2000).

Несмотря на вышеуказанные достоинства метод ПЦР все же не лишен

некоторых недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований.

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа. Это, прежде всего, ошибки, связанные с нарушением правил забора, хранения и транспортировки проб. Поскольку, эти процедуры могут осуществляться вне ПЦР-лаборатории, большое внимание следует уделять обучению медицинского персонала, выполняющего забор проб, так как именно от него во многом зависит качество ПЦР-анализов. Случаи тотальной контаминации выявляются без труда по появлению линии "положительной" ДНК во всех пробах, включая отрицательный контроль. Реагенты, загрязненные "положительной" ДНК, подлежат ликвидации. Повторная реакция ставится с новыми реагентами.

Вторую группу составляют ошибки, связанные с неверной диагностической стратегией врача, использующего ПЦР-диагностику. Приведем примеры таких ошибок.

Первая, когда не учитывает специфичность используемых тест-систем. Больной А. с предполагаемым диагнозом "респираторный хламидиоз" направлен на исследование хламидий в соскобе с задней стенки глотки. При постановке ПЦР использовалась видоспецифическая тест-система, выявляющая фрагмент генома С.trachomatis. Результат исследования отрицательный. Врач снимает предполагаемый диагноз. Однако у больного может иметь место инфекция, вызванная С. pneumonia, C. pecorum, C. psitaci, которые не улавливаются данной тест-системой. Поэтому при назначении ПЦР-исследования больному врач должен четко представлять границы специфичности применяемых тест-систем.

Врач не учитывает особенности персистенции и элиминации возбудителя. Больная Б. с хроническим хламидийным цервицитом направлена на контрольное исследование через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии. Результат анализа положительный. Делается вывод о неэффективности проведенной терапии. Такое заключение может быть ошибочно в силу того, что погибшие и персистирующие хламидии дают положительный результат ПЦР-анализа. Окончательный вывод об излеченности можно сделать не ранее, чем через 5-6 недель после курса антибиотикотерапии. Это срок необходим для смены эпителиального слоя, в клетках которого паразитируют хламидии.

Вторая - клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую является необоснованным аргументом практических врачей для сомнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у 40% - 60% лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при оценке результатов исследования, совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий - "инфицированность" и "инфекционная болезнь".

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики) при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов

Следует обратить внимание на случаи несовпадения результатов ПЦР-анализа с результатами других исследований, например, с результатами определения антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА). Существует случай, когда ПЦР-анализ на хламидии дает отрицательный результат при положительном титре противохламидийного IgG. Причиной подобного расхождения могут быть: 1) "иммунологический след" - остаточный уровень IgG после ранее перенесенной хламидийной инфекции. У некоторых людей повышенный уровень антител может сохраняться многие месяцы и годы после полного выздоровления, что связано с индивидуальными особенностями иммунной системы; 2) при проведении ИФА использовалась родоспецифическая тест-система, выявляющая все виды хламидий, в том числе, респираторные - С. pneumonia, C. pecorum, C. psitaci, а при проведении ПЦР-анализа - видоспецифическая на С. trachomatis. В случае хламидийной инфекции, вызванной С. pneumonia, результат ИФА будет положительным, а результат ПЦР-анализа - отрицательным; 3) материал для ПЦР-анализа получен не из места локализации инфекционного агента. Например, при хроническом сальпингите хламидии могут быть не обнаружены в области шейки матки, а наличие инфекционного процесса будет сопровождаться выработкой антител.

Возможна и обратная ситуация, когда при положительном результате ПЦР-анализа не выявляются специфические антитела. При хронических инфекциях, которые зачастую сопровождаются иммунодепрессией, такая картина бывает не редко. Так при хроническом хламидиозе до 5% больных имеют титр противохламидийных антител, не превышающий критического уровня. При первичной инфекции следует также учитывать серонегативный период, когда, несмотря на клинические проявления заболевания антитела класса IgG в крови не выявляются. Для урогенитальных инфекций этот период может составлять до 2-х недель.