Методы диагностики HELICOBACTER PYLORI
В эпидемиологической практике выделение чистой культуры Helicobacter pylori необходимо для внутривидового типирования штаммов, что может быть использовано при мониторинге для дифференциации между реинфекцией новым штаммом и рецидивированием, которое может быть обусловлено тем же штаммом. В научной практике бактериологический метод важен, так как позволяет изучать факторы патогенности Helicobacter pylori, изготовлять препараты для серологической диагностики, создать банк штаммов для эпидемиологических и других исследований, так как штаммы бактерии в замороженном виде при температуре -70°С могут храниться в течение 5-7 лет. Без этого метода невозможно дальнейшее научное изучение микроорганизма. Однако этот метод достаточно дорогой. Кроме того, он сопряжен с определенными трудностями, обусловленными необходимостью наличия специальных сред, оптимальной температуры, влажности, качества атмосферного воздуха и т.д. Это приводит к тому, что рост колоний микроорганизмов удается получить далеко не всегда. Неудобство метода связано и с тем, что его результатов приходится ждать, как правило, не менее 10-14дней. В клинической практике он применяется в основном в случаях инфекции Helicobacter pylori, резистентной к обычным схемам антигеликобактерной терапии. Helicobacter pylori крайне «капризен», требует специальных условий культивирования и дорогостоящего оборудования. Большой шаг вперед в успешном культивировании Helicobacter pylori принадлежит транспортным средам, которые дают возможность продлить срок транспортировки биоптата из эндоскопического кабинета в микробиологическую лабораторию до суток (среды Стюарта, Кэри-Блэйера, Био Мерьо).
Посевы инкубируются при температуре 37°С, влажности 98%, в микроаэрофильных условиях в течение 3-10 сут. Helicobacter pylori растет в атмосфере, содержащей 5% кислорода, 5-10% углекислого газа, остальное составляет азот. Для данного микроорганизма губительны как анаэробные условия, так и более высокое содержание кислорода. Для создания микроаэрофильной атмосферы используют газогенераторные пакеты, которые продуцируют газовые смеси после добавления в них воды. Оптимальный рост колоний наблюдают при рН среды от 6,7 до 8,0. Многие штаммы Helicobacter pylori могут расти и развиваться в достаточно широком диапазоне температур при +32°С . +39°С, но не растут при +27°С .+42°С. Время инкубации: первичное исследование - 7 дней, контроль лечения - 14 дней.
На неселективной питательной среде Helicobacter pylori на 3-5 сутки при первичном посеве и на 2 сутки при пересевах чистой культуры формирует мелкие, круглые, гладкие, прозрачные, росинчатые колонии диаметром 1-3 мм. На селективной питательной среде колонии Helicobacter pylori приобретают характерное золотисто-желтое окрашивание, за счет присутствующего в этой среде трифенилтетразолий хлорида. При появлении колоний, сходных по морфологии с Helicobacter pylori (диаметром до 0,5 - 2 мм в виде «капель росы» или при сплошном росте, образующие прозрачную пленку), происходит их идентификация. Предложена методика полуколичественного определения обсеменения слизистой оболочки желудка в зависимости от числа выросших микробных колоний: до 10 колоний в чашке (1+), 10-20 колоний (2+), 20-50 колоний (3+), более 50 колоний (4+).
Для идентификации мазки окрашивают по Граму. Под микроскопом в случае Helicobacter pylori обнаруживают грамотрицательные изогнутые палочки. Проводят биохимическое типирование - уреазная, каталазная, оксидазная активность, Helicobacter pylori не ферментирует глюкозу, не продуцирует нитраты, не образует индол.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР):
Метод предназначен для качественного обнаружения ДНК Helicobacter pylori в биологических образцах (биоптаты антрального отдела желудка, биоптаты двенадцатиперстной кишки, биоптаты десен, мазки из зубодесневого кармана, слюна).
Позволяет оценить генотипические и фенотипические характеристики возбудителя. Почти у каждого пациента имеется уникальный штамм Helicobacter pylori. Выявлено, что вирулентность Helicobacter pylori во многом обусловливает клинические проявления инфекции.
Существует ряд генов, продукты которых - белки Cag A, Vac A, Ice A, Bab A - полагают факторами патогенности.
В зависимости от их наличия выделяют два типа штаммов Helicobacter pylori. Экспрессирующие Cag A- и Vac A-токсин относятся к первому типу, штаммы второго типа не экспрессируют указанные гены и считаются менее патогенными. Среди большого многообразия гибридизационных методов анализа ДНК, метод ПЦР наиболее широко используется в клинической лабораторной диагностике.