Методы получения
Соответствие требованиям GMP , как важного показателя качества, исключительно важно. Причем, оно должно быть не по отдельным элементам, а концептуальным. Это должно быть и соответствие требованиям GMP всех материалов, контактирующих с продуктом, и применение автоматической мойки и стерилизации на месте ( CIP / SIP ), и валидируемость ( IQ / OQ ), и документирование процесса ферментации, и многое другое.
в Фильтрация
Обычно для отделения мицелия от культуральной жидкости применяют вакуум-барабанные фильтры непрерывного действия. Фильтрацию начинают до начала автолиза мицелия, поскольку при фильтрации автолизированной культуры мицелий не образует плотной пленки на фильтрующей поверхности барабана, а налипает в виде отдельных тонких комков, которые сами не отходят в зоне «отдувки» фильтра, и их приходится удалять вручную. При этом продолжительность фильтрации увеличивается в 2 - 3 раза, выход фильтрата резко падает, а сам фильтрат получается очень мутным.
Необходимо тщательно соблюдать условия, препятствующие разрушению пенициллина во время фильтрации, - охлаждение нативного раствора до 4-6°С и систематическая (после каждой загрузки) обработка фильтра, коммуникаций и сборников антисептиками, например хлорамином. Фильтр также должен систематически стерилизоваться острым паром.
г Предварительная обработка нативного раствора
Нативный раствор (фильтрат культуральной жидкости) представляет собой более или менее мутную, окрашенную в желто-коричневый или зеленовато-коричневый цвет жидкость. Величина рН среды в зависимости от штамма продуцента, состава среды и продолжительности процесса ферментации обычно колеблется от 6,2 до 8,2.
Очень важной характеристикой нативного раствора является содержание в нем белковых веществ, определяемых осаждением трихлоруксусной кислотой или другим соответствующим методом.
Применяется несколько способов предварительной обработки нативного раствора с целью освобождения от белковых примесей: осаждение солями многовалентных металлов (например, А13+ Fе3+ или Zn2+), коагуляция танином, термическая коагуляция при температуре 60-75°С и рН 5,5 - 6,0, осаждение примесей катионными детергентами типа четвертичных аммониевых оснований (например, цетилпиридиний-бромидом или додецилтриметиламмонийхлоридом и т.п.). Применение этих методов приводит к потерям антибиотика. Обычно в результате коагуляции и последующей фильтрации или сепарирования теряется от 5 до 15%) пенициллина. При этом коагуляция солями металлов позволяет удалять не более 50% общего количества белковых веществ.
д Экстракция и очистка пенициллина
Нативный раствор содержит 3-6% сухих веществ. На минеральные вещества приходится 30-40% сухого остатка, от 15 до 30% приходится на пенициллин, а остальное представляет сложную смесь органических веществ, включая белки, полипептиды, низкомолекулярные азотистые соединения, углеводы, различные органические кислоты и, в зависимости от штамма продуцента, то или иное количество пигмента. Для выделения пенициллина из этой сложной смеси можно пользоваться методами, основанными на адсорбции, экстракции или осаждении.
В промышленности извлечение активного вещества из нативного раствора основано на экстракции не смешивающимся с водой растворителем при подавленной диссоциации карбоксильной группы пенициллина. В растворитель, кроме пенициллина, переходит большая часть органических кислот. Минеральные загрязнения, большая часть азотистых соединений и других органических веществ остаются в водной фазе, так что в результате экстракции чистота продукта увеличивается в 4-6 раз.
К растворителям, применяемым для экстракции пенициллина, предъявляются следующие основные требования:
) малая растворимость в воде;
) отсутствие взаимодействия с пенициллином;
) низкая упругость пара при температуре 5-30°С;
) возможность регенерации при температуре не выше 120 - 140°;
) низкая стоимость.
С учетом этих и ряда других показателей основными растворителями-экстрагентами были приняты бутилацетат и амилацетат.